文章來源：結(jié)核與肺部疾病雜志，2022，3(1)：60-64

doi：10.19983/j.issn.2096-8493.20210157

作者：羅麗娟，陳燕

作者單位：中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，長沙 410011

通信作者：陳燕，Email：chenyan99727@csu.edu.cn

基金資助：國家自然科學(xué)基金(81873410)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，患病率與病亡率均較高。肺氣腫是COPD主要的病理表現(xiàn)之一，其發(fā)生發(fā)展與蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞炎癥、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。但是，目前關(guān)于肺氣腫的發(fā)病機制及病程進展的原因尚未完全闡明，建立疾病動物模型為進一步了解其生理病理機制提供了有效且有實踐意義的實驗平臺。本研究對既往已建立的肺氣腫動物模型方法及相關(guān)進展進行綜述。

關(guān)鍵詞：肺疾病，慢性阻塞性；疾病模型，動物；綜述文獻(主題)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以長期肺通氣不足，持續(xù)慢性氣道炎癥導(dǎo)致肺組織破壞和肺功能下降為特點的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。COPD的高發(fā)病率及病亡率，給患者和社會帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。COPD可由多種因素誘導(dǎo)，其發(fā)病機制非常復(fù)雜，包括蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡、免疫衰老異常等。然而其具體的發(fā)病機制尚未完全闡明，通過建立有效的動物模型，有助于我們進一步了解和探索其生理和病理機制，為疾病的治療與預(yù)防提供新思路及科學(xué)理論依據(jù)。肺氣腫作為COPD的主要病理特征，一直是COPD發(fā)生機制的研究重點。為了探索COPD的病因和發(fā)病機制，許多學(xué)者對肺氣腫的動物模型進行了相關(guān)研究。盡管這些模型僅模仿了COPD的某些特征，但它們對于進一步研究人類COPD的發(fā)病機制非常有意義。因此，筆者將著重對肺氣腫動物模型研究進展進行闡述。

目前，用于肺氣腫的動物模型常見的有小鼠與大鼠，也有應(yīng)用綿羊、狗、兔、豚鼠等來建模。動物模型可以在一定程度上反映人類疾病的病理和生理學(xué)特征。肺氣腫的大多數(shù)特征，如炎性細(xì)胞聚集、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子和蛋白酶的產(chǎn)生、小氣道和血管重塑，以及肺功能下降，可以在不同的模型中誘導(dǎo)。

小鼠用于構(gòu)建肺氣腫模型已被廣泛研究，小鼠的基因組較其他動物與人類更為接近，并具有相對較為廣泛的基因、蛋白質(zhì)序列、抗體可用性，且小鼠用于建模的成本較低，最重要的是，目前存在許多小鼠種屬的可供研究選擇，并且根據(jù)研究目的不同可構(gòu)建特定的小鼠，從而更好地闡明某些特定基因在肺氣腫發(fā)病中的作用。因此，小鼠被認(rèn)為更適合肺氣腫的實驗研究。

大鼠的體積相對小，建模成本低，建模周期短，且基因組與人類相似。有研究指出，暴露于香煙煙霧(CS)僅2個月就可出現(xiàn)肺氣腫的表現(xiàn)，這比豚鼠和小鼠的煙熏建模時間相對較短。但大鼠也有其自身的局限性。大鼠的支氣管分支很少，氣管內(nèi)纖毛分布較少，腺黏膜下腺體不成熟，氣管黏膜下沒有杯狀細(xì)胞，且大鼠支氣管炎癥介質(zhì)也與人類不同。此外，研究者認(rèn)為大鼠在建模過程會出現(xiàn)輕微的疾病，如果煙霧暴露過多，會產(chǎn)生非特異性顆粒過載效應(yīng)。

豚鼠建模具有許多優(yōu)點，包括易于識別的肺氣腫，比小鼠更明顯的小氣道重塑，以及氣道中相當(dāng)大的杯狀細(xì)胞化生的發(fā)展。研究指出，長期暴露于CS的豚鼠可出現(xiàn)肺部炎癥、肺動脈血壓升高和肺血管肌肉化、小氣道重塑和肺氣腫，并與肺功能改變(如阻力增加)相關(guān)。其主要的缺點是成本高，且缺乏進行分子研究的工具，以及與豚鼠蛋白交叉反應(yīng)的商業(yè)抗體數(shù)量有限。

一、CS暴露誘發(fā)的肺氣腫模型

根據(jù)臨床統(tǒng)計，大約90%的COPD患者是吸煙者。吸煙是肺氣腫的最重要危險因素之一。長期接觸CS的動物可能導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)，其主要是由巨噬細(xì)胞刺激引起的，肺組織病理表現(xiàn)為支氣管腔變窄，支氣管軟骨組織受損，導(dǎo)致肺泡破裂和(或)融合以及肺氣腫的形成，這類似于人類對吸煙產(chǎn)生的反應(yīng)。CS暴露誘發(fā)的肺氣腫可以盡可能模擬人類肺氣腫的發(fā)病機理，為人類肺氣腫的基礎(chǔ)和臨床研究提供基礎(chǔ)。CS暴露方法因其成本低、操作簡單、成功率高而被廣大研究者接受，并且可以消除客觀環(huán)境中的實驗差異。肺氣腫動物模型的CS暴露時間長短由于香煙種類不同，暴露方式、持續(xù)時間和頻率不同，煙氣密度不同，動物的物種和年齡不同而有所不同。

1.部分(僅鼻子或頭部)暴露法：C57BL/6J小鼠通過鼻吸入CS， 2次/d，2支香煙/次，10支噴霧劑/香煙，5d/周。暴露4個月后，小鼠肺組織病理結(jié)果表明肺泡隨著吸煙時間的增加而增大。同時，吸煙小鼠肺組織中的B淋巴細(xì)胞增加，與人類肺氣腫相似。

2.全身暴露法：將實驗動物作為一個整體放置在吸煙盒(裝滿煙的盒子)中。C57BL/6J小鼠暴露于CS中，每天吸煙3次，3支香煙/次。8周后，觀察到肺部出現(xiàn)肺氣腫樣變化，并伴有肺泡巨噬細(xì)胞增多，細(xì)胞外基質(zhì)變化和MMP-12表達(dá)增加；或C57BL/6J小鼠每天吸煙2次，5支香煙/次，每周6天，暴露12周，觀察小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡腔增大、肺泡間隔變窄等病理變化。

二、香煙煙霧提取物(cigarette-smoke-extract，CSE)腹腔注射誘導(dǎo)的肺氣腫模型

既往研究者發(fā)現(xiàn)在小鼠腹腔內(nèi)注射CSE可產(chǎn)生顯著的肺氣腫，假設(shè)CSE可以作為抗原，觸發(fā)免疫反應(yīng)引起肺氣腫樣改變，僅用了6周就成功建立肺氣腫模型。此外，有研究指出，腹膜內(nèi)注射CSE構(gòu)建肺氣腫小鼠模型，建模結(jié)束后，對小鼠進行肺功能檢測、收集血液，支氣管肺泡灌洗液和肺組織形態(tài)學(xué)檢測。結(jié)果表明，腹膜內(nèi)注射CSE可導(dǎo)致肺功能下降、肺泡間隙增大、肺泡壁破壞、肺組織細(xì)胞凋亡、慢性肺部炎癥、氧化應(yīng)激水平增加等。這種建模方法的有效性與CS暴露誘發(fā)的肺氣腫動物模型有效性相當(dāng)，相較于傳統(tǒng)的CS暴露建模，腹腔注射CSE建模明顯縮短了建模周期。

在C57BL/6J或者BALB/c小鼠腹腔注射CSE(CSE制備：5支香煙溶于10ml磷酸鹽緩沖液里，經(jīng)濾嘴過濾后使用，每次注射前現(xiàn)配現(xiàn)用)，建模為期4周。模型組在第1天、第11天、第22天進行CSE腹腔注射，對照組則注射生理鹽水或磷酸鹽緩沖液；第29天，建模結(jié)束，根據(jù)研究目的對小鼠進行相應(yīng)的處理及收集樣本。

三、彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫模型

氣管內(nèi)滴注彈性蛋白酶破壞了肺組織中蛋白酶-抗蛋白酶之間的平衡，不僅破壞了保護肺組織免受損傷的主要因素，而且還產(chǎn)生了大量的炎癥因子，加速了肺泡壁的破裂與融合，從而誘發(fā)肺氣腫。常用的彈性蛋白酶包括：木瓜蛋白酶、豬胰彈性蛋白酶(pig pancreatic elastinase，PPE)等。用彈性蛋白酶構(gòu)建肺氣腫動物模型的方法具有操作簡單和建模周期較短等優(yōu)點。因此，直接氣管內(nèi)滴入彈性蛋白酶是誘導(dǎo)肺氣腫動物模型的常見有效方法之一。

木瓜蛋白酶是一種來自植物的蛋白水解酶，是最早用于誘導(dǎo)肺氣腫模型的彈性蛋白酶。2mg/kg木瓜蛋白酶溶液一次性經(jīng)氣管滴入建立穩(wěn)定肺氣腫模型，為期1周。

PPE不僅可以充當(dāng)?shù)鞍酌竵砥茐牡鞍酌?抗蛋白酶失衡，還可以作為氧化劑來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，在二者共同作用下，動物模型中的肺泡顯著增大。因此，PPE常被用來誘發(fā)肺氣腫。PPE誘導(dǎo)途徑主要包括氣管內(nèi)滴注、氣管切開注射、霧化吸入。PPE濃度為0.6 IU左右，為期4~6周。

四、化學(xué)物質(zhì)刺激誘導(dǎo)的肺氣腫模型

許多化學(xué)物質(zhì)，包括NO₂、脂多糖(LPS)、氯化鉻(CdCl2)等都可能引起炎癥和肺氣腫。小鼠長期暴露于NO₂(NO₂體積分?jǐn)?shù)20×10⁶，每天14h，持續(xù)25d)后，通過促進氧化應(yīng)激可引起小鼠肺氣腫；LPS(1mg/kg的50μl無菌生理鹽水溶液稀釋)主要通過刺激嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞引起氣道和肺組織炎癥，釋放出一系列炎癥介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)等，引發(fā)蛋白酶-蛋白酶失衡，最終發(fā)生肺氣腫。將0.5ml 0.025% CdCl₂溶液一次性滴入小鼠的氣管中可以誘導(dǎo)出肺氣腫的動物模型。

五、與基因相關(guān)誘導(dǎo)的肺氣腫模型

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因敲除誘導(dǎo)的肺氣腫動物模型已被廣泛用于肺氣腫的研究。利用基因靶向和(或)轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)成為研究不同疾病的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)的主要技術(shù)方法。有研究指出，Abhd2基因敲除小鼠由于炎性細(xì)胞因子和蛋白酶基因的過度表達(dá)、巨噬細(xì)胞增多、細(xì)胞凋亡異常，以及缺乏對蛋白酶抑制劑的抵抗力，導(dǎo)致小鼠肺部出現(xiàn)肺氣腫樣變化。并且這些改變與臨床上肺氣腫發(fā)生發(fā)展具有相似之處。血小板源性生長因子-β(PDGF-β)和TNF-α等可能干擾肺泡的正常發(fā)育，且既往研究發(fā)現(xiàn)，這些基因的過度表達(dá)可能破壞肺泡受損和修復(fù)兩者之間的平衡，導(dǎo)致肺氣腫的形成。

上述5種肺氣腫動物模型制備方法的優(yōu)缺點具體見表1。

建立動物模型之后，需要進行相應(yīng)的評估以判斷模型是否構(gòu)建成功。常規(guī)檢測指標(biāo)包括肺功能指標(biāo)、氣道炎癥指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)和病理形態(tài)指標(biāo)。肺功能指標(biāo)包括記錄氣道阻力(Raw)、肺動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)、呼氣峰流量(PEF)、吸氣時間/呼氣時間(Ti/Te)和血氣分析。氣道炎癥指標(biāo)包括肺泡灌洗液細(xì)胞計數(shù)與分類、TGF-β、IL-6、IL-8、TNF-α等，以及彈性蛋白酶、組織蛋白酶和單核細(xì)胞趨化性蛋白1。氧化應(yīng)激指標(biāo)包括超氧化物歧化酶(SOD)與活性氧(ROS)、核因子相關(guān)因子2。病理形態(tài)學(xué)指標(biāo)包括平均線性截距(MLI)、破壞性指數(shù)(DI)、凋亡指數(shù)(AI)和呼吸道的病理評分。

肺氣腫是肺實質(zhì)的一種破壞性過程，其特征是終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端的間隙永久性增大伴隨肺泡壁的破壞。成功的肺氣腫動物模型表現(xiàn)為肺功能降低、炎癥指標(biāo)升高、氧化應(yīng)激水平增加和肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯。然而，肺功能檢測被認(rèn)為不如形態(tài)學(xué)變化指標(biāo)敏感，可能只在嚴(yán)重的氣道重塑或肺實質(zhì)破壞中檢測到，而在輕度肺氣腫動物模型中肺功能可能正常。有研究者指出微觀結(jié)構(gòu)的定量評估是證明肺氣腫改變存在的一種有效方法。目前，尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)去評判肺氣腫模型。但是考慮到各種參數(shù)的可及性、客觀性和穩(wěn)定性，我們認(rèn)為病理形態(tài)學(xué)指標(biāo)(包括MLI、DI、AI)的變化是評估建立肺氣腫動物模型的最重要參數(shù)。

吸煙是肺氣腫發(fā)病最常見的危險因素。CS暴露被認(rèn)為是構(gòu)建肺氣腫動物模型的傳統(tǒng)方法。CS暴露引起的肺氣腫可以模擬人類相對復(fù)雜的病理變化，被認(rèn)為是目前最合理的肺氣腫動物模型。但是，由于建模時間長，研究人員一直在探索新的建模方法。

迄今為止，還沒有完美的實驗性肺氣腫動物模型與人類肺氣腫的發(fā)病機理和特征完全一致。盡管小鼠和人類具有許多相似的生理過程，但是考慮到人類與小鼠之間在肺部結(jié)構(gòu)、功能和免疫學(xué)方面的特定差異，兩者之間也不盡相同。即使在小鼠體內(nèi)，不同的種屬對肺氣腫的發(fā)展也表現(xiàn)出不同的敏感性。隨著對肺氣腫的研究不斷深入，研究者提出了越來越多的替代誘導(dǎo)方法。因此，我們不僅應(yīng)根據(jù)研究目的建立相應(yīng)的肺氣腫動物模型，還應(yīng)通過多種建模方法探討肺氣腫的發(fā)病機制。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相信未來將會有更合理和更規(guī)范的肺氣腫動物模型應(yīng)用于實驗研究。

參考文獻略